การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

       การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช เป็นวิธีการขยายพันธุ์พืชวิธีหนึ่ง แต่มีการปฏิบัติภายใต้สภาพที่ควบคุม เรื่อง ความสะอาดแบบปลอดเชื้อ อุณหภูมิ และแสง ด้วยการนำชิ้นส่วนของพืชที่ยังมีชีวิต เช่น ลำต้น ยอด ตาข้าง ก้านช่อดอก ใบ ก้านใบ อับละอองเกสร เป็นต้น มาเพาะเลี้ยงบนอาหารสังเคราะห์ และชิ้นส่วนนั้นสามารถ เจริญและพัฒนาเป็นต้นพืชที่สมบูรณ์ มีทั้งส่วนใบ ลำต้น และรากที่สามารถนำออกปลูกในสภาพธรรมชาติได้ ที่ผ่านมามีการนำเทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชประยุกต์ใช้กับงานด้านเภสัชวิทยา และชีววิทยา แต่ปัจจุบันมีการพัฒนา และนำมาใช้แก้ปัญหาหรือเพื่อประโยชน์ในภาคเกษตร และภาคอุตสาหกรรมกันมาก ขึ้น เช่น การนำเมล็ดไผ่มาผลิต-ขยายด้วยวิธีเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เมื่อครั้งเกิดเหตุการณ์ไผ่ออกดอกประมาณปี 2538 หรือการนำหน่อที่มีคุณลักษณะที่ดีของหน่อไม้ฝรั่งมาผลิต-ขยายด้วยวิธีเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เพื่อลดปัญหา การใช้เมล็ดซึ่งมีการคละเพศ นอกเหนือจากราคาของเมล็ดพันธุ์ที่ค่อนข้างสูง และยังต้องนำเข้าจากต่างประเทศ อีกด้วย เป็นต้น

ประโยชน์ของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

คุณสมบัติที่ถูกนำมาใช้ให้เกิดประโยชน์ของวิธีเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อมีหลายข้อพอสรุปได้ดังนี้
1. สามารถผลิตต้นพันธุ์พืชปริมาณมาณมากในระยะเวลาอันรวดเร็ว ตัวอย่างเช่น หากพืชสามารถเพิ่ม ปริมาณได้ 3 เท่า ต่อการย้ายเนื้อเยื่อลงอาหารใหม่ทุกเดือนๆ ละ 1 ครั้ง เมื่อเวลาผ่านไป 6 เดือน จะสามารถผลิต ต้นพันธุ์พืชได้ถึง 243 ต้น
2. ต้นพืชที่ผลิตได้จะปลอดโรค โดยเฉพาะโรคที่มีสาเหตุจากเชื้อไวรัส มายโคพลาสมา ด้วยการตัด เนื้อเยื่อเจริญที่อยู่บริเวณปลายยอดของลำต้น ซึ่งยังไม่มีท่อน้ำท่ออาหาร อันเป้นทางเคลื่อนย้ายของเชื้อโรค ดังกล่าว
3. ต้นพืชที่ผลิตได้ จะมีลักษณะทางพันธุกรรมเหมือนต้นแม่ คือ มีลักษณะตรงตามพันธุ์ ด้วยการใช้ เทคนิคของการเลี้ยงจากชิ้นตาพืชพัฒนาเป็นต้นโดยตรง หลีกเลี่ยงขั้นตอนการเกิดกลุ่มก้อนเซลล์ที่เรียกว่า แคลลัส
4. ต้นพืชที่ผลิตได้จะมีขนาดสม่ำเสมอ ผลผลิตที่ได้มีมาตรฐานและเก็บเกี่ยวได้คราวละมากๆ พร้อมกัน หรือในเวลาเดียวกัน
5. เพื่อการเก็บรักษาหรือแลกเปลี่ยนพันธุ์พืชระหว่างประเทศ เช่น การมอบเชื้อพันธุ์กล้วยในสภาพปลอดเชื้อ ขององค์กรกล้วยนานาชาติ (INIBAP) ให้กรมส่งเสริมการเกษตร เมื่อปี พ.ศ. 2542
6. เพื่อประโยชน์ด้านการสกัดสารจากต้นพืช นำมาใช้ประโยชน์ด้านต่างๆ เช่น ยาฆ่าแมลง ยารักษาโรค เป็นต้น

พันธุ์พืชที่ทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ
1. อ้อย
2. เบญจมาศ
3. สตรอเบอรี่
4. หน่อไม้ฝรั่ง
5. ขิง
6. มันฝรั่ง
7. สับปะรด
8. สมุนไพร
9. กล้วย
10. กระเจียว/ปทุมมา
11. ปูเล่
12. ไผ่
13. กล้วยไม้ป่า
14. สมุนไพร

ห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยง

ห้องปฏิบัติการ ประกอบด้วยส่วนสำคัญ 3 ส่วน คือ
1. ห้องเตรียมอาหาร ควรเป็นห้องที่มีโต๊ะสำหรับเตรียมสารเคมี อ่างน้ำ ตู้เย็น สำหรับเก็บสารละลายเข้มข้น เครื่องชั่ง เครื่องวัดความเป็นกรด – ด่าง เตาหลอมอาหาร หม้อนึ่งฆ่าเชื้อจุลินทรีย์แบบความดันไอน้ำ

2. ห้องถ่ายเนื้อเยื่อ เครื่องมือสำคัญในห้องนี้คือ ตู้สำหรับเลี้ยงหรือถ่ายเนื้อเยื่อ เป็นตู้ที่มีอากาศถ่ายเทผ่านแผ่นกรอง ที่สามารถกรองจุลินทรีย์ไว้ได้ตลอดเวลา ทำให้อากาศภายในตู้บริสุทธิ์ ช่วยให้ทำงานสะดวกรวดเร็ว

3. ห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช สภาพแวดล้อมที่เหมาะสมในการเลี้ยงเนื้อเยื่อจะแตกต่างกันสำหรับพืชแต่ละชนิด โดยทั่วไปมักจะปรับสภาพแวดล้อมภายในห้องให้มีอุณหภูมิประมาณ 25 องศาเซลเซียส ระยะเวลาที่ให้แสงประมาณ 12 – 16 ชั่วโมง / วัน ความเข้มของแสง 1,000 – 3,000 ลักซ์

การดูแลห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชจะต้องสะอาดอยู่เสมอ หมั่นตรวจดูขวดหรือภาชนะที่เลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ถ้าพบว่ามีจุลินทรีย์ขึ้นปะปน จะต้องรีบนำออกไปต้มฆ่าเชื้อและล้างทันที ไม่ให้เป็นที่ สะสมเชื้อจุลินทรีย์ซึ่งอาจแพร่กระจายภายในห้องได้

อุปกรณ์ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ
1. พันธุ์พืชที่จะนำมาเพาะเลี้ยงควรสะอาด ปราศจากโรคและเป็นส่วนที่สำคัญที่ยังอ่อนอยู่ เช่น ตาเป็นอวัยวะที่ดีที่สุด ส่วนใบ ดอก ราก ก็สามารถนำมาเลี้ยงได้
2. เครื่องแก้วต่าง ๆ ได้แก่ ฟลาสค์ บีคเกอร์ ปิเปตต์ จานเพาะเชื้อ กระบอกตวง ขวดสำหรับเลี้ยงเนื้อเยื่อ
3. สารเคมีต่าง ๆ
3.1 สารเคมีที่ใช้ฆ่าเชื้อที่ติดมากับผิวพืช เช่น คลอรอกซ์ เอททิลแอลกฮอล์ เมอคิวริคคลอไรด์ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
3.2 สารเคมีที่ใช้เตรียมสูตรอาหารต่าง ๆ
3.3 สารเคมีที่ควบคุมการเจริญเติบโต
3.4 น้ำตาลซูโครส
3.5 วุ้น
4. เครื่องมือผ่าตัด ได้แก่ มีดผ่าตัด ปากคีบ
5. ตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ
6. อุปกรณ์เบ็ดเตล็ดต่าง ๆ
7. อาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ

ความสำเร็จในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชขึ้นอยู่กับปัจจัยหลายอย่าง สิ่งที่สำคัญมากอย่างหนึ่งคือองค์ประกอบของอาหารที่เหมาะสม ซึ่งต้องประกอบด้วยอาหารที่พืชสามารถนำไปใช้อย่างมี ประสิทธิภาพ สูตรอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช ประกอบด้วยส่วนต่าง ๆ ดังนี้
1. สารอนินทรีย์
2. สารประกอบอินทรีย์
3. สารที่ได้จากธรรมชาติ 4. สารไม่ออกฤทธิ์

สารอนินทรีย์ ได้แก่ ธาตุอาหารหลัก คือ ธาตุอาหารที่พืชจำเป็นต้องใช้ในปริมาณมาก เช่น ไนโตรเจน ฟอสฟอรัส โปรแตสเซียม กำมะถัน แคลเซียม แมกนีเซียม และธาตุอาหารรองหรือธาตุอาหารที่พืชจำเป็นใช้ในปริมาณน้อย เช่น แมงกานีส สังกะสี ทองแดง โมลิบดีนัม โบรอน ไอโอดีน โคบอล คลอรีน
สารประกอบอินทรีย์ แบ่งออกได้หลายพวก คือ
2.1 น้ำตาล
2.2 ไวตามิน ชนิดที่มีความสำคัญ ได้แก่ ไธอะมีน
2.3 อมิโนแอซิค เช่น ไกลซีน

สารควบคุมการเจริญเติบโต ได้แก่ ออกซิน ไซโตไคนิน จิบเบอเรลลิน
สารอินทรีย์พวก อิโนซิทอล อะดีนีน ช่วยส่งเสริมให้เกิดยอด ซิตริคหรือแอสคอบิคแอซิดช่วยลดน้ำตาลที่บริเวณชิ้นส่วนพืช
สารที่ได้จากธรรมชาติ เช่น กล้วยบด น้ำมะพร้าว น้ำส้มคั้น น้ำมะเขือเทศ
สารไม่ออกฤทธิ์ เช่น วุ้นช่วยให้พืชตั้งอยู่ได้ ผงถ่านช่วยดูดซับสารพิษที่พืชสร้าง ออกมาและเป็นพิษกับพืชเอง
การเตรียมสารละลายเข้มข้น
การเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช จะไม่เตรียมโดยการชั่งสารเคมีในแต่ละครั้งที่เตรียม แต่จะเตรียมเป็นสารละลายเข้มข้น คือ การรวมสารเคมีพวกที่สามารถรวมกันได้โดยไม่ตกตะกอน ไว้ด้วยกัน

วิธีการเตรียมเริ่มจากชั่งสารเคมีตามจำนวนที่ต้องการ ละลายสารแต่ละชนิดให้หมดก่อนแล้วจึงนำมาผสมกัน เติมน้ำกลั่นให้ได้ปริมาณที่ต้องการ กวนให้เข้ากัน แล้วจึงบรรจุในขวดสารละลาย ลงรายละเอียดชนิดของสาร ความเข้มข้น วันเดือนปี ปริมาตร แล้วเก็บในตู้เย็น
วิธีการเตรียมอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
1. นำสารละลายเข้มข้นชนิดต่าง ๆ มาผสมกัน ค่อย ๆ กวนให้เข้ากันจนหมดครบทุกชนิด
2. เติมน้ำตาล แล้วเติมน้ำกลั่นให้ได้ปริมาตรที่ต้องการ ปรับ pH 5.6 – 5.7
3. นำวุ้นผสมกับอาหารที่เตรียม หลอมวุ้นให้ละลาย
4. บรรจุลงในขวดอาหารในปริมาตรเท่า ๆ กัน ปิดฝาให้สนิท

การฆ่าเชื้อจุลินทรีย์
การฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ในอาหาร
นำขวดที่บรรจุอาหารแล้วไปนึ่งฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดันไอน้ำที่อุณหภูมิ 121 องศาเซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์ / ตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 – 20 นาที

การฆ่าเชื้อจุลินทรีย์บริเวณภายนอกชิ้นส่วนพืช
เป็นสิ่งจำเป็นและสำคัญที่จะต้องฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ที่ติดมากับบริเวณผิวนอกของชิ้นส่วนพืช เนื่องจากอาหารที่ใช้เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชมีธาตุอาหารและไวตามิน ที่จุลินทรีย์ต่าง ๆ เจริญได้ดีและรวดเร็วกว่าเนื้อเยื่อพืช การฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ที่ทำได้สะดวกและได้ผลดี โดยการใช้สารเคมีชนิดที่สามารถฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ได้หมดทุกชนิด และล้างออกได้ง่าย เพราะถ้าล้างออกได้ยาก สารเคมีเหล่านี้จะมีผลทำให้เนื้อเยื่อพืชตาย หรือมีการเจริญเติบโตไม่ดีเท่าที่ควร
การเติมน้ำยาซักฟอกลงไปในสารเคมีที่ใช้ฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ จะทำให้ประสิทธิภาพสารเคมีเหล่านั้นดีขึ้น เนื่องจากจะทำให้ลดแรงตึงผิวบริเวณผิวนอกของชิ้นส่วนพืช สารเคมีจะแทรกซึมเข้าไปทำลายจุลินทรีย์ตามซอกต่าง ๆ ได้ดีขึ้น การเตรียมสารเคมีฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ทำโดยตวงสารให้ได้ปริมาณตามที่ต้องการ แล้วเติมน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อและน้ำยาซักฟอกลงไป เขย่าให้เข้ากัน การเตรียมนี้ควรเตรียมใหม่ทุกครั้งที่ใช้

วิธีการเลี้ยงเนื้อเยื่อ
1. นำชิ้นส่วนพืชที่ต้องการมาล้างน้ำให้สะอาด
2. ตกแต่งชิ้นส่วนพืช ตัดส่วนที่ไม่ต้องการออก
3. นำชิ้นส่วนพืชจุ่มในแอลกอฮอล์ 95 % เพื่อลดแรงตึงผิวบริเวณนอกชิ้นส่วนพืช
4. นำชิ้นส่วนพืชมาเขย่าในสารฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ที่เตรียมไว้นาน 10 – 15 นาที
5. ใช้ปากคีบคีบชิ้นส่วนพืช ล้างในน้ำกลั่นที่นึ่งฆ่าเชื้อ 3 ครั้ง
6. ตัดชิ้นส่วนพืชตามขนาดที่ต้องการแล้ววางบนอาหารสังเคราะห์
7. ลงรายละเอียด เช่น ชนิดพืช วันเดือนปี หรือรหัส ในการทำการฆ่าเชื้อที่ติดมากับผิวพืช และการนำไปเลี้ยงบนอาหารทำในตู้ถ่ายเนื้อเยื่อ โดยตลอด

การดูแลเนื้อเยื่อระหว่างการเลี้ยง
1. นำขวดเลี้ยงเนื้อเยื่อไปวางบนชั้นในห้องเลี้ยงเนื้อเยื่อ โดยปรับสภาพแวดล้อมให้เหมาะสมโดยทั่วไปปรับอุณหภูมิภายในห้องประมาณ 25 องศาเซลเซียส ระยะเวลาที่ให้แสงประมาณ 12 – 16 ชั่วโมง / วัน ความเข้มของแสง 1,000 – 3,000 lux
2. เนื้อเยื่อพืชที่เลี้ยงควรเปลี่ยนอาหารใหม่ทุก 2 สัปดาห์ ระหว่างการเลี้ยงตรวจดู
3. การเจริญเติบโต สังเกตุการเปลี่ยนแปลง บันทึกรายงานไว้เพื่อเป็นข้อมูล
4. การย้ายพืชออกจากขวดเลี้ยงเนื้อเยื่อเพื่อลงปลูกในกระถาง

เมื่อพืชเจริญเติบโตเป็นต้นที่สมบูรณ์แล้ว ก็นำลงปลูกในกระถางดังนี้
1. เตรียมทราย : ถ่านแกลบ หรือ ทราย : ขุยมะพร้าว อัตราส่วน 1 : 1 ใส่กระถางหรือกระบะพลาสติค
2. ใช้ปากคีบ คีบต้นพืชออกจากขวดอย่างระมัดระวัง
3. ล้างเศษวุ้นที่ติดอยู่บริเวณรากออกให้หมด
4. จุ่มยากันรา ตามอัตราส่วนที่กำหนดในสลากยา

ปลูกในกระถางหรือกระบะ
นำไปไว้ในตู้ควบคุมความชื้น แสง อุณหภูมิ หรือนำไว้ในกระบะพ่นหมอก เมื่อพืชเจริญตั้งตัวดีแล้วจึงย้ายลงแปลงปลูกต่อไป